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2022-06-27
液相色譜是實(shí)驗(yàn)室使用頻率非常高的儀器設(shè)備,在使用過程中會(huì)有許多小技巧和注意事項(xiàng),今天小編就跟大家一起扒一扒流動(dòng)相使用的那些事兒。
液相色譜示意圖
從上圖我們可以看出來,流動(dòng)相在整個(gè)液相系統(tǒng)中起著重要的作用,類似我們身體的血液,起著運(yùn)輸?shù)淖饔?,關(guān)于流動(dòng)相那些事兒,我們一起來看看吧。
1、流動(dòng)相選擇原則(反相體系中)
由強(qiáng)到弱:
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn),這樣可以很快地得到分離結(jié)果,然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
三倍規(guī)則:
每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量,保留因子約增加3倍,此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)較為省力的辦法。調(diào)整的過程中,注意觀察各個(gè)峰的分離情況。
粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào):
當(dāng)分離達(dá)到一定合適的程度,應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%,并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整幅度,直至各組分的分離情況更為理想。
2、流動(dòng)相的pH值
采用反相色譜法分離弱酸(3≤pKa≤7)或弱堿(7≤pKa≤8)樣品時(shí),通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值,以抑制樣品組分的解離,增加組分在固定相上的保留,并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸,流動(dòng)相的pH值越小,組分的K值越大,當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí),弱酸主要以分子形式存在;對(duì)弱堿,情況相反。分析弱酸樣品時(shí),通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸,常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液;分析弱堿樣品時(shí),通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿,常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。
3、鹵代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問題
鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì),能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解,不能存放太久。鹵代溶劑(如,CCL4、CHCL3等)與各種醚類(如,乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等)混合后,可能會(huì)反應(yīng)生成一些對(duì)不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物,這種混合流動(dòng)相應(yīng)盡量不采用,或新鮮配制。此外,鹵代溶劑(如CH2CL2)與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑(如乙腈)混合靜置時(shí),還會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶??傊?,鹵代溶劑更好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合,則不會(huì)產(chǎn)生類似問題。
4、選對(duì)濾膜很重要
微孔濾膜的材質(zhì)(化學(xué)兼容性)
選擇微孔濾膜時(shí),首先要考慮化學(xué)兼容性。濾膜是否耐酸、堿、有機(jī)溶劑等。幾種常見濾膜的特性及應(yīng)用如下所示:
① 聚醚砜濾膜(PES)
特性:親水性、高流速、高通量、低蛋白吸附、低溶出物、耐高壓滅菌。
應(yīng)用:一般試劑,樣品的實(shí)驗(yàn)室過濾;超純水、食品、飲料等的過濾;血清樣品的過濾。
② 醋酸纖維素濾膜(CA)
特性:親水性、低吸附能力、低非特異性結(jié)合能力、熱穩(wěn)定性。
應(yīng)用:蛋白質(zhì)和酶過濾;樣品前處理過濾中更為廣泛使用的濾膜之一。
③ 混合纖維素濾膜(MCE)
特性:親水性、高流速、由硝酸纖維素和醋酸纖維素混合而成。
應(yīng)用:微生物和顆粒分析;無菌測(cè)試。
④ 硝酸纖維素濾膜 (NC)
特性:親水性、耐弱酸、高蛋白結(jié)合能力。
應(yīng)用:微生物檢測(cè)與捕獲等;微量元素分析等;醫(yī)學(xué)研究及診斷方面的生物工程,生化分析等。
⑤ 聚偏二氟乙烯濾膜(PVDF)
特性:疏水性、高靈敏度、機(jī)械強(qiáng)度高、蛋白吸附低、具有良好的耐熱性及化學(xué)穩(wěn)定性。
應(yīng)用:氣體及蒸汽過濾, 高溫液體過濾,溶劑和化學(xué)原料的凈化過濾;油類中不溶物的凈化;化學(xué)物質(zhì)的分離和提純。
⑥ 聚四氟乙烯濾膜(PTFE)
特性:疏水性、具有廣泛的化學(xué)兼容性、耐溫性好、抗強(qiáng)酸強(qiáng)堿、化學(xué)腐蝕性較強(qiáng)的溶劑及氧化劑。
應(yīng)用:化工、醫(yī)藥、食品、能源等領(lǐng)域,幾乎能過濾所有的有機(jī)溶液;強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的過濾;高溫液體的過濾;特殊化學(xué)試劑的過濾;氣體的澄清過濾。
⑦ 尼龍濾膜(NY)
特性:親水性、耐溫性能好、強(qiáng)度高、化學(xué)穩(wěn)定性好、耐稀酸稀堿等。
應(yīng)用:樣品的除菌,過濾;工業(yè)水的過濾。
⑧聚丙烯濾膜(PP)
特性:耐酸堿、耐磨損、耐沖擊、微孔分布均勻、過濾面積大、透水性好。
應(yīng)用:在藥品、飲料、日常用水、廢水、空氣過濾等方面廣泛應(yīng)用。
濾膜的孔徑
具體實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)該根據(jù)您的過濾目的實(shí)驗(yàn)需求來選擇合適的孔徑的濾膜和濾器。
0.1μm: 能去除樣品中的支原體。
0.2μm:可以去除99.99%的細(xì)菌微生物,達(dá)到GMP或者藥典的除菌要求,還可以去除樣品、流動(dòng)相中極細(xì)微的顆粒。
0.45μm: 能濾除大多數(shù)細(xì)菌微生物,對(duì)常規(guī)樣品、流動(dòng)相等的過濾,能滿足一般色譜要求。
0.8μm及以上:可以過濾較大顆粒的雜質(zhì)或者難處理、渾濁樣品的預(yù)處理,經(jīng)預(yù)處理后再選擇相應(yīng)濾膜進(jìn)行過濾。
5、注意事項(xiàng)
水相溶液
對(duì)于水相溶液來說,首要的問題是防止污染。對(duì)于溶劑瓶我們要做的非常重要的工作就是勤換流動(dòng)相,常換常新,夏天對(duì)于純水或者純鹽流動(dòng)相可以配置后放入冰箱冷藏,臨時(shí)用放置至室溫。
有機(jī)相溶液
對(duì)于有機(jī)相溶液,可以不用擔(dān)心細(xì)菌繁殖的問題。但是有機(jī)相容易發(fā)生聚合,特別是乙腈在適宜的光照條件下極易發(fā)生聚合,瓶子里就會(huì)出現(xiàn)一些絮狀的聚合沉淀物。為了防止聚合過程的發(fā)生,裝乙腈時(shí)要用棕色的溶劑瓶,避免陽光直射,更換乙腈時(shí)應(yīng)當(dāng)棄去瓶底剩余的溶液。
清洗過濾
溶劑瓶里的過濾頭,其作用是為了防止溶液瓶中的顆粒雜質(zhì)進(jìn)入到儀器的流路系統(tǒng)中,它的材質(zhì)通常分為玻璃燒結(jié)石英或不銹鋼,如果不慎堵塞會(huì)造成流動(dòng)相吸液不暢,在管路中造成氣泡,需進(jìn)行清洗,玻璃材質(zhì)的通常是用稀硝酸泡,而不銹鋼材質(zhì)的可以直接進(jìn)行超聲清洗。