今天，小編繼續(xù)給大家?guī)?lái)液相色譜你問(wèn)我答第五彈~

1 那怎么才能避免拖尾呢？

答：首先我們需要找到產(chǎn)生拖尾的原因，拖尾通常由以下幾個(gè)原因造成：柱外接口體積擴(kuò)大、柱床污染以及被分析物與鍵合活性位點(diǎn)相互作用而產(chǎn)生的，這就需要根據(jù)不同原因來(lái)分別對(duì)待處理。

2 怎么檢查拖尾的原因？

答：首先要仔細(xì)觀察色譜圖，在不知道樣品性質(zhì)和色譜條件的情況下，色譜圖可以提供很多線索，再借助其余的條件來(lái)驗(yàn)證基于色譜圖的猜想。di一檢查峰高，觀察色譜柱是不是在此色譜條件下過(guò)載了，為了確認(rèn)是否真的過(guò)載，可以再進(jìn)1/10 濃度的樣品看看峰型是否有改善。如果低濃度下依然拖尾，再觀察色譜圖，如果色譜中有很多峰，看各個(gè)峰型是保持一定的拖尾程度還是隨著時(shí)間推移峰型有一致的變化趨勢(shì)，如果圖譜中前邊的峰比后邊的峰拖尾的更厲害，可以考慮柱外效應(yīng)的影響。如果色譜圖中所有峰的拖尾程度一致，那么有兩個(gè)可能：1）柱床損壞，2）是圖譜中所有樣品組分化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，拖尾是因化學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的。

3 哪些物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生這些化學(xué)效應(yīng)，能說(shuō)明下嗎？怎么解決？

答：化學(xué)效應(yīng)有好幾種，更常見(jiàn)的就是分析物與不均一的活性表面的相互作用。典型的就是堿性化合物在反相柱中的拖尾，通常帶有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等極性或堿性基團(tuán)的化合物能與填料表面殘留的硅羥基和鍵合相發(fā)生次級(jí)吸附作用，進(jìn)而產(chǎn)生拖尾。

解決途徑： 

1）分析堿性化合物可以在流動(dòng)相中添加三乙胺(TEA)作為減尾劑，TEA與堿性化合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合硅羥基，用于消除分析物與殘留硅羥基間的相互作用。

2）酸性化合物拖尾則需要降低流動(dòng)相的pH值，盡量使酸質(zhì)子化，可以通過(guò)向流動(dòng)相中加入競(jìng)爭(zhēng)的有機(jī)酸，如使用0.1%三氟乙酸 (TFA) 得到了比較好的結(jié)果，并且這種添加劑具有比較低的紫外截止波長(zhǎng)。

3）提高流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度，抑制離子作用。

4）在流動(dòng)相中添加離子對(duì)試劑，反相流動(dòng)相中一般加入0.003-0.01mol/L的離子對(duì)試劑，改善峰型和增加化合物保留。

5）選擇高純硅膠色譜柱和徹底封端柱，例如：月旭Ultimate? Polar-RP，Xtimate? C18 等。

4 但我在有些色譜圖中，會(huì)看到色譜峰前沿，是什么會(huì)導(dǎo)致前沿呢？

答：首先我們也需要找到前沿的原因，前沿通常有以下幾個(gè)原因：柱外體積、柱床污染以及溶劑效應(yīng)。這就需要我們通過(guò)觀察色譜圖來(lái)查找原因進(jìn)而解決問(wèn)題。當(dāng)然過(guò)載的情況，我們也是通過(guò)降低樣品濃度來(lái)驗(yàn)證，如果低濃度依然前沿，再觀察色譜圖，如果色譜中有很多峰，所有峰，看各個(gè)峰型是保持一定的前沿程度還是隨時(shí)間前沿峰型有一致的變化趨勢(shì)，如果圖譜中前邊的峰比后邊的峰前沿更厲害，可以考慮柱外效應(yīng)或溶劑效應(yīng)的影響。如果色譜圖中所有峰的前沿程度一致，那么可能是柱床損壞或圖譜中的樣品物質(zhì)性質(zhì)導(dǎo)致。

5 怎么解決峰前沿呢？

答：1）溶劑效應(yīng)導(dǎo)致的峰前沿，在反相LC中，如使用1OO%有機(jī)溶劑或1OO%強(qiáng)溶劑，大體積進(jìn)樣時(shí)，將使色譜峰過(guò)早洗脫出色譜柱，導(dǎo)致峰變形，可以用峰形前沿抑制器來(lái)避免這個(gè)問(wèn)題。在液相色譜中用溶于流動(dòng)相的小體積進(jìn)樣更為理想?；蛘哂昧鲃?dòng)相或與流動(dòng)相極性差不多的溶劑溶解樣品，如果一定要使用強(qiáng)溶劑溶解，那需要減少進(jìn)樣體積。

2）柱外效應(yīng)導(dǎo)致的峰前沿，我們需要減少儀器系統(tǒng)的死體積，進(jìn)而解決前沿現(xiàn)象。

3）對(duì)于樣品性質(zhì)導(dǎo)致的峰前沿，可以考慮增加流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度，而增加流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度，減少因靜電的作用引起的前沿，或者在流動(dòng)相中加適量的四氫呋喃（通常加入的量在5%內(nèi)即可），當(dāng)然升高柱溫也是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

4）色譜柱渦流

填料產(chǎn)生的空隙使流動(dòng)相及溶質(zhì)的流速比平均流速移動(dòng)更快，從而導(dǎo)致峰拖尾或前伸?？障懂a(chǎn)生的原因是填充不當(dāng)，或填充柱床塌陷。

5）假前沿

兩個(gè)物質(zhì)未分離開(kāi)，但出現(xiàn)一定的分離趨勢(shì)。

峰前沿案例分析：C18，流動(dòng)相是水－甲醇（55：45），做出來(lái)的對(duì)照品和樣品峰都前延?

1）樣品是否過(guò)載。降低進(jìn)樣濃度，看峰形是否有所改善。一般認(rèn)為峰高在100mAU左右比較合適，不至于因過(guò)載影響峰形。

2) 檢查是否是用流動(dòng)相溶解樣品。溶解樣品的溶劑（如純甲醇）洗脫能力比流動(dòng)相強(qiáng)會(huì)發(fā)生峰前延。具體機(jī)理是：正常的峰形應(yīng)該是樣品在色譜柱上均勻的前移的情況下得到的，濃度分布在整個(gè)通過(guò)色譜柱柱床的過(guò)程中任何時(shí)候都呈正態(tài)分布。樣品溶液進(jìn)樣后到達(dá)色譜柱時(shí)間很短，應(yīng)還未被流動(dòng)相充分稀釋，洗脫能力更強(qiáng)的樣品溶劑的局部存在，將使部分樣品被洗脫的速度加快，導(dǎo)致峰前延。

3）增加流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度。增加緩沖鹽濃度可以增大流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度，減少因靜電的作用（有可能存在于樣品分子之間、也有可能存在于樣品分子與填料表面之間）引起的前延。

4）流動(dòng)相中加入適量的四氫呋喃。往流動(dòng)相中加入少量的四氫呋喃有時(shí)可以改善峰形、增大分離度，很多色譜工作者都知道和使用，但其機(jī)理似乎少人提及。通常所加入的量在5％以內(nèi)即可，需要的時(shí)候可以加入更大的量。 

6 液相色譜柱應(yīng)該如何活化?

答：對(duì)于液相色譜柱而言，每根色譜柱在裝運(yùn)之前都經(jīng)過(guò)了測(cè)試，并存放在測(cè)試洗脫液中進(jìn)行運(yùn)輸。因此，在shou次使用時(shí)，反相柱建議80%的甲醇使用檢測(cè)樣品1/2的流速?zèng)_洗4小時(shí)，再用流動(dòng)相徹底地平衡色譜柱即可進(jìn)樣分析。如果使用流動(dòng)相添加劑（如緩沖液或離子對(duì)試劑），建議使用含原有比例但不含這些添加劑的流動(dòng)相進(jìn)行中間過(guò)渡10至20個(gè)色譜柱體積再更換成分析樣品流動(dòng)相。對(duì)于具有較短化學(xué)鏈（例如C8、苯基、CN）鍵合相的色譜柱，應(yīng)小心確保在使用色譜柱之前對(duì)其進(jìn)行徹底的平衡。這樣可確保重復(fù)性，并有助于防止保留時(shí)間的漂移。

正相溶劑和反相溶劑是不互溶的，這一點(diǎn)不能忽略。對(duì)于新購(gòu)柱子，首先請(qǐng)注意打開(kāi)分析測(cè)試說(shuō)明書(shū)，了解柱子的保存溶劑。如果保存溶劑與你將要使用的流動(dòng)相不互溶，請(qǐng)先用異丙醇過(guò)渡。過(guò)渡過(guò)程中注意因異丙醇粘度較大，會(huì)導(dǎo)致柱壓升高，適當(dāng)調(diào)低流速。如果流動(dòng)相中含有緩沖鹽類，先用不含緩沖鹽的同比例流動(dòng)相過(guò)渡，避免緩沖鹽的析出。

7 我在使用氨基柱分析糖類物質(zhì)時(shí)，為什么目標(biāo)物的保留時(shí)間會(huì)不穩(wěn)定，逐漸前移呢？

答：這是由氨基柱的特性造成的，因?yàn)榘被诜治鎏穷悤r(shí)，典型的流動(dòng)相是60%~90%的乙腈水混合液，當(dāng)在使用過(guò)程中，填料空隙處高濃度的氨基基團(tuán)顯堿性，導(dǎo)致硅膠和鍵合相緩慢的水解，隨著時(shí)間的推移，脫落的鍵合相越來(lái)越多，就會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物的保留時(shí)間發(fā)生變化，同時(shí)這也是氨基柱在反相條件下壽命變短的原因。

8 色譜柱壓力高

答：色譜柱壓力升高是液相工作者們?cè)趯?shí)際應(yīng)用過(guò)程中較為常見(jiàn)的問(wèn)題，首先考慮“堵”。壓力升高的主要原因總結(jié)為以下幾點(diǎn)：

1. 色譜柱入口篩板堵塞；

2. 樣品或流動(dòng)相緩沖鹽在色譜柱內(nèi)析出；

3. 色譜柱污染；

4. 流動(dòng)相粘度過(guò)高；

5. 在線過(guò)濾器或者保護(hù)柱堵塞；

6. 管線堵塞；

7. 聚合物色譜柱：溶劑改變導(dǎo)致溶脹。

解決途徑：

1．用標(biāo)準(zhǔn)流速的1/4流速反沖色譜柱，不接檢測(cè)器，去除篩板堵塞物。（除1.8μm粒徑色譜柱外）

2．盡量選用流動(dòng)相做樣品溶劑，減少樣品析出的可能。盡可能降低流動(dòng)相中鹽的濃度。使用帶鹽的流動(dòng)相后，應(yīng)使用與流動(dòng)相中鹽相等比例的超純水和有機(jī)相沖洗色譜柱10到20柱體積，再保存在適宜的溶劑中。

3．色譜柱污染，需要對(duì)色譜柱清洗再生。

4．盡量選擇粘度小的溶劑做流動(dòng)相，或者升高柱溫。

5．檢查在線過(guò)濾器濾頭以及保護(hù)柱柱芯，必要時(shí)更換。

6．拆卸管線以便確證，必要時(shí)更換。

7．對(duì)于聚合物基質(zhì)的色譜柱，需要了解溶劑兼容性信息。 

9 色譜柱壓力低?

答：色譜柱壓力降低，首先考慮“漏”。壓力升低的主要原因總結(jié)為以下幾點(diǎn)：

1. 溶劑進(jìn)口過(guò)濾芯堵塞；

2. 連接管路泄漏或其他備件（泵頭密封墊）；

3. 溶劑或流速改變；

4. 泵入口閥失靈；

5. 泵出口閥失靈；

6. 色譜柱失效，固定相流失。

解決途徑：

1、檢查各管路及密封墊等備件；

2、更換色譜柱；

3、檢查色譜條件是否改變；

4、檢查泵流量準(zhǔn)確。

10 液相的死體積和延遲體積?

答：1）死體積

指的是有效進(jìn)樣點(diǎn)到有效檢測(cè)點(diǎn)之間排除色譜柱中包含固定相部分的體積。包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過(guò)程，其他 3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。

2）延遲體積

延遲體積指的是溶劑混合點(diǎn)（通常在液相色譜儀的混合腔內(nèi)或比例閥中）與LC柱頭之間的體積。