1 概述

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是生物體內(nèi)的一類(lèi)重要的代謝酶，參與外源和內(nèi)源有毒物質(zhì)的代謝。GST通過(guò)催化還原型的谷胱甘肽（GSH）和有毒物質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng)，使有毒化合物的水溶性增加從而更容易排出體外，更終達(dá)到解毒的作用。利用這個(gè)原理，將GST做成標(biāo)簽表達(dá)出融合蛋白，與帶谷胱甘肽配基的親和介質(zhì)特異性結(jié)合，從而純化出目標(biāo)蛋白，再用特異性的酶將GST標(biāo)簽切除從而得到天然蛋白。

2 GST標(biāo)簽

GST標(biāo)簽是一種常見(jiàn)的標(biāo)簽，它能夠增加外源蛋白的可溶性，很好地保留了蛋白的抗原性和生物活性，可在不同的宿主中表達(dá)，適應(yīng)范圍廣，能夠提高外源蛋白的穩(wěn)定性，可用不同的蛋白酶去除且具有高特異性，純化方便、溫和。但它也有一定的缺點(diǎn)，比如分子量較大，可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能和下游實(shí)驗(yàn)，因此純化后需要去除標(biāo)簽，并且如果蛋白不可溶，很難用變性的方法純化。

3 GST親和層析

GST親和層析是利用GST融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過(guò)硫鍵共價(jià)結(jié)合，通過(guò)GSH交換洗脫的原理來(lái)進(jìn)行純化。該純化柱中，凝膠手臂上通過(guò)硫鍵結(jié)合一個(gè)GSH，然后利用其與GST-tag之間酶和底物的特異性作用力，使得帶GST標(biāo)簽的融合蛋白能夠與凝膠上的GSH結(jié)合，從而將標(biāo)簽蛋白與其他蛋白分離開(kāi)。

4 月旭GST親和層析填料

5 GST融合蛋白純化步驟

1、將GST Tanrose 4FF 裝入合適的層析柱，層析用5倍柱體積的結(jié)合Buffer進(jìn)行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋白的作用。

2、將樣品加到平衡好的GST Tanrose 4FF中（保證目的蛋白與GST Tanrose 4FF充分接觸，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。

3、用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

4、使用5-10倍柱體積的洗脫Buffer，收集洗脫液，即目的蛋白組分。

5、依次使用3倍柱體積的結(jié)合Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料，更后再用5倍柱體積的20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被細(xì)菌污染。

6 應(yīng)用實(shí)例

層析柱：PreCot 5ml GST 4FF；

樣品：重組表達(dá)GST標(biāo)簽蛋白；

結(jié)合緩沖液：20mM PB , 150mM NaCl, PH7.4；

洗脫緩沖液：15mM還原型谷胱甘肽, 50mM Tris PH 8.0。

7 常見(jiàn)問(wèn)題解答

1. GST蛋白結(jié)合效率低，該怎么辦？

①可能原因：上樣流速太快，結(jié)合時(shí)間太短。

解決方法：降低流速，保證足夠的結(jié)合時(shí)間。

②可能原因：緩沖液不合適，柱子平衡不到位。

解決方法：將緩沖液pH控制在3-12之間，用至少5倍的柱體積平衡柱子。

③可能原因：樣品中GST融合蛋白濃度太低。

解決方法：先濃縮樣品，再進(jìn)行純化。

④可能原因：GST蛋白發(fā)生變性或聚集。

解決方法：選擇合適的細(xì)胞破碎方式；發(fā)生聚集時(shí)可嘗試添加1-10mM的DTT促進(jìn)蛋白溶解；GST蛋白與核酸結(jié)合或蛋白之間結(jié)合時(shí)可添加適量NaCl（100-300mM）。

2、GST蛋白洗脫困難，該怎么做？

①可能原因：洗脫強(qiáng)度不夠。

解決方法：增加洗脫體積數(shù)；調(diào)整洗脫緩沖液pH（8-9）或離子強(qiáng)度（100-300mM氯化鈉）。

②可能原因：非特異性吸附。

解決方法：洗脫緩沖液中加入1%-2% Triton X-100。

③可能原因：洗脫緩沖液中的谷胱甘肽被氧化了。

解決方法：洗脫緩沖液需現(xiàn)配現(xiàn)用，也可嘗試加入1-5mM的DTT。

3. GST蛋白純化后純度太低，該怎么做？

①可能原因：GST融合蛋白降解。

解決方法：加入蛋白酶抑制劑防止降解。

②可能原因：在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)過(guò)程中GST標(biāo)簽脫落。

解決方法：嘗試更換宿主細(xì)胞或者優(yōu)化序列。