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快來(lái)看看吧,峰值保留時(shí)間不穩(wěn)定要這么做

2021-05-27

在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遇到保留時(shí)間不穩(wěn)定的問(wèn)題,我們也總接觸到相關(guān)問(wèn)題的技術(shù)咨詢。我們的技術(shù)工程師深知大家的痛點(diǎn),特根據(jù)大家的反饋,梳理了一個(gè)從發(fā)現(xiàn)問(wèn)題到處理問(wèn)題的解決思路。以后再遇到保留時(shí)間不穩(wěn)定的問(wèn)題,就可以輕松搞定啦。

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保留時(shí)間不穩(wěn)定,會(huì)是什么問(wèn)題?

首先要找出變化的模式,

這個(gè)會(huì)幫助我們找到很多潛在的原因。 

#1 保留時(shí)間在同一天變化大,同一瓶流動(dòng)相,同一根色譜柱,同一臺(tái)儀器

1)首先檢查泵和混合器。使用秒表和量筒來(lái)檢測(cè)流速(設(shè)置儀器流速1ml/min,用10ml量筒收集流出液10分鐘,應(yīng)該得到液體約10ml±0.5ml,量筒有誤差,使用的試劑與儀器廠家標(biāo)定泵流速時(shí)試劑不一樣,更終體積也有些差異,如果超過(guò)這個(gè)范圍,再分開通道檢測(cè),以找到流速不正確的原因,并排除);

2)檢查流動(dòng)相組成是否變化,可以在流動(dòng)相中加入跟蹤劑來(lái)觀察基線的變化,例如:反相條件,UV檢測(cè)器,在有機(jī)相中加入0.1%丙酮,監(jiān)測(cè)254nm下的基線變化,還有一種方法人工配制流動(dòng)相,然后通過(guò)混合器,這時(shí)候保留時(shí)間穩(wěn)定了,不再波動(dòng),那就是混合器工作不正常,或者混合不均勻,進(jìn)行排除。 

#2 保留時(shí)間一天之內(nèi)正常,不同天數(shù)之間變化 

1)儀器本身不太可能有問(wèn)題,可能是流動(dòng)相的組成變化引起的,在反相色譜中,保留因子k和流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑的體積含量成指數(shù)關(guān)系,根據(jù)經(jīng)驗(yàn),如果有機(jī)溶劑含量誤差在1%,那保留時(shí)間的變化在5%-15%之間,大部分變化在10%左右,意味著用稱量有機(jī)溶劑的方式配置流動(dòng)相能得到更穩(wěn)定的保留時(shí)間;

2)流動(dòng)相的脫氣方式也可能導(dǎo)致,更好的脫氣方式是使用真空超聲脫氣大約1分鐘左右,非真空條件下超聲脫氣5分鐘,這樣會(huì)Z大程度的減少溶劑的揮發(fā),還有一種方法是流動(dòng)相中通過(guò)氦氣,流動(dòng)相被氦氣平衡后,氦氣流立刻關(guān)閉,避免氦氣帶走溶劑蒸汽,而導(dǎo)致溶劑組成改變;

3)流動(dòng)相的抽濾方式,通常情況下,如果我們使用有機(jī)溶劑和水相混合流動(dòng)相時(shí),會(huì)先將流動(dòng)相配置混勻好后,再進(jìn)行抽濾,這樣的好處是流動(dòng)相混合更均勻,但是對(duì)于流動(dòng)相中沸點(diǎn)較低的部分,在抽濾過(guò)程中會(huì)損失更大,導(dǎo)致流動(dòng)相溶劑組成改變,建議有機(jī)相和水相分開抽濾,再進(jìn)行混合,超聲脫氣; 

4)檢測(cè)目標(biāo)物是離子狀態(tài)或者離子化的,那么控制流動(dòng)相的pH就非常重要,就算是0.1單位pH的變化都有可能導(dǎo)致保留時(shí)間漂移10%左右,所以準(zhǔn)確稱量pH值并保證pH儀被很好的校正了,在反相色譜柱中,隨著pH值的升高,酸的保留會(huì)減少,堿的保留會(huì)增加。

反相色譜中,分離離子或離子化的樣品,保留時(shí)間會(huì)受到正確緩沖溶液的離子強(qiáng)度的影響,但影響會(huì)很小,可以不計(jì),典型狀況是緩沖鹽的摩爾數(shù)改變20%,保留時(shí)間的變化是1%,緩沖鹽的組成通常是稱量的,那么大的誤差是不會(huì)發(fā)生的。

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#3 保留時(shí)間漂移

還有影響保留時(shí)間的一個(gè)重要問(wèn)題就是保留時(shí)間漂移(一直延長(zhǎng)或一直縮短)。

1)大部分工作者認(rèn)為漂移是平衡的問(wèn)題,如果使用的是未修飾硅膠柱做正相色譜,這是更有可能的原因,使用半飽和流動(dòng)相改善。反相色譜中,平衡通常會(huì)很快,5-10個(gè)柱體積的流動(dòng)相通常就足夠平衡了,但不全是如此,典型的就是離子對(duì)色譜中,使用離子對(duì)試劑平衡色譜柱,由于離子對(duì)試劑的濃度在2-5mmol/L甚至更低的濃度,它們要吸附在反相色譜柱填料表面,表面濃度在0.5-2μmol/m2,1根4.6*250mm的色譜柱大約有3g填料,需要2mmol的離子對(duì)試劑進(jìn)行完全的柱平衡,流動(dòng)相濃度為2mmol時(shí),那需要1L流動(dòng)相進(jìn)行平衡,這個(gè)雖然是J端條件,但是用幾百毫升的流動(dòng)相去平衡色譜柱也是正常的,因此離子對(duì)色譜中,使用了有機(jī)溶劑清除了離子對(duì)試劑,這樣第二天需要更長(zhǎng)的時(shí)間平衡色譜柱。這兩個(gè)現(xiàn)象都是流動(dòng)相中有低濃度的強(qiáng)吸附試劑導(dǎo)致的,這是保留時(shí)間漂移更常見的原因,也還有別的原因。

2)樣品中含有強(qiáng)吸附劑,在重復(fù)進(jìn)樣中會(huì)慢慢累積,從而改變色譜柱的化學(xué)性質(zhì),如:藥品的賦形劑??梢酝ㄟ^(guò)觀察保留時(shí)間變化的速率來(lái)得知雜質(zhì)是從流動(dòng)相中引入還是樣品中引入。實(shí)驗(yàn)如下:

● 進(jìn)樣幾次,如:進(jìn)樣四次,共使用了1個(gè)小時(shí);

● 走相同量的流動(dòng)相,不進(jìn)樣;

● 重復(fù)第一步;

● 做一個(gè)關(guān)系圖;

保留時(shí)間:▲ 對(duì)時(shí)間的關(guān)系     ▲ 對(duì)進(jìn)樣次數(shù)的關(guān)系

如果第一個(gè)圖得到一條平滑的曲線,那么流動(dòng)相是引入雜質(zhì)的原因,如果第二個(gè)圖得到一條平滑的曲線,那么雜質(zhì)的來(lái)源是樣品。

3)鍵合相水解,色譜柱制造商會(huì)制定一個(gè)pH范圍,超出范圍可能導(dǎo)致鍵合相不穩(wěn)定,然而,很多情況下使用者不得不在接近這個(gè)pH極限,但是并沒有一個(gè)明顯的分界線,因?yàn)樗膺€取決于其他因素,如:溫度,有機(jī)溶劑,緩沖鹽的濃度和種類,樣品的化學(xué)性質(zhì)等,因此這個(gè)水解也可能發(fā)生在這個(gè)pH范圍內(nèi)。要保存固定相的水解穩(wěn)定性,更好是在中性pH值(3-5左右)和低溫下。等度條件穩(wěn)定性優(yōu)于梯度條件,在等度條件下發(fā)生水解的過(guò)程中,鍵合相通常會(huì)發(fā)生自我吸附,并達(dá)成一種區(qū)域平衡,在使用高濃度的有機(jī)溶劑時(shí),在梯度時(shí)或者沖洗色譜柱時(shí),這種平衡會(huì)被打破,鍵合相被沖出色譜柱。

4)溫度的變化,如果樣品是自動(dòng)分析過(guò)夜或者過(guò)了周末,那保留時(shí)間的漂移可能和實(shí)驗(yàn)室的溫度變化有關(guān),在很多地方,室溫的設(shè)置在晚上或者周末是不一樣的,一般來(lái)講,1℃的變化導(dǎo)致保留時(shí)間的漂移大約在1%到2%。這個(gè)可以聯(lián)系更后一個(gè)導(dǎo)致保留時(shí)間漂移的原因--柱壓的增加,柱壓的異常升高,表明色譜柱被污染,僅僅是篩板被堵塞就可能導(dǎo)致保留時(shí)間漂移,這是因?yàn)椋瑸榱耸沽鲃?dòng)相通過(guò)篩板,需要額外的壓力來(lái)促使流動(dòng)相通過(guò)篩板,這會(huì)使流動(dòng)相在摩擦的過(guò)程中受熱,從而導(dǎo)致保留時(shí)間的漂移。

5)反相色譜鍵合相發(fā)生了“相塌陷”,由于流動(dòng)相中有機(jī)溶劑比例太少,高鍵合覆蓋率、“完全封端”的C18沒有很好的被流動(dòng)相浸潤(rùn),這會(huì)使得流動(dòng)相和固定相沒有很好的接觸,造成鍵合相卷曲,固定相之間相互吸附,從而導(dǎo)致固定相可以和樣品相互作用的表面積減少,使得保留時(shí)間逐漸變短。這時(shí)候立即用一定量的有機(jī)溶劑(建議40%乙腈水)沖洗色譜柱可以使鍵合相恢復(fù),這種現(xiàn)象在短鏈烷烴結(jié)合,未封尾的反相鍵合相上則很少發(fā)生,或者是不發(fā)生。

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